青蒿素历史争鸣：低温提取是创新吗？
►青蒿
导 言：
自2015年青蒿素的研究获诺贝尔奖以来，各种媒体传播低温萃取青蒿素是科技创新，用乙醚低温提取抗疟有效成分是科学创新还是继承？用沸点比乙醇低的乙醚提取青蒿是来源于东晋葛洪《肘后备急方》中的“青蒿一握，以水一升渍，绞取汁，尽服之”的启示还是其他原因？本文作者将做较为详尽的分析。
撰文 | 曾美怡
责编 | 小 雨
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2011年拉斯克临床医学奖和2015年诺贝尔生理学或医学奖授予屠呦呦个人，这是国际科学界对中国科学界在抗疟药青蒿素的成就给予的高度评价，是一种善意和尊重的表示。正因为这是科学奖，我们就必须用客观和严谨的态度为这个奖项提供准确的信息。但是无论是拉斯克奖的奖项说明或是诺奖推荐人苏新专和米勒撰文阐述屠呦呦的贡献时, 均提到是由于葛洪书中的“青蒿一握，以水二升渍，绞取汁，尽服之”的记载，使屠呦呦认识到传统的水煮或高温提取会破坏有效成分，因而重新设计提取方法，用乙醚低温提取，从而显著提高了有效成分的稳定性[1] [2]。
关于是低温提取还是其他因素，黎润红等的文中也曾提出过疑问“到底是因为考虑到低温还是因为考虑到亲脂部位而改用乙醚提取，或是因为从《肘后备急方》中看到还是从“本草和民间”的“绞汁”得到启发，现在无从定论”[3]，但是他们未做深入探讨。
屠呦呦本人1972年3月8日在南京的汇报会上介绍这个经验时说，“从本草及民间‘绞汁’服用中得到启发，使我们考虑到有效成分可能在亲脂部分，于是改用乙醚提取，这样动物效价才有了显著的提高”[4]。
这里姑且不说“绞汁”是否可以理解为有效成分在亲脂部分，但是用亲脂性较强的乙醚代替乙醇是一种合理的选择，其中也并没有提到选择乙醚是考虑到需要低温提取。那么是谁提出低温提取的说法呢？早在2009年，屠呦呦就在她的书中写道：在她看了东晋葛洪《肘后备急方》中将青蒿“绞汁”用药的经验，从“青蒿一握，以水一升渍，绞取汁，尽服之”截疟，悟及可能有忌高温或酶解等有关的思路，改用沸点比乙醇低的乙醚提取，并将该提取物分为中性和酸性两部分，经反复实验，才于1971年10月4日分离获得的191号[5] 。在2011年的《自然医学》上屠呦呦再次发表文章，认为从葛洪的《肘后备急方》中有关“青蒿一握，以水二升渍，绞取汁，尽服之”能缓解疟疾的记载，想到过去采取常规的加热提取可能破坏了有效成分，而低温提取对保存其抗疟有效成分是必须的[6]。从此，各种媒体也开始传播低温萃取青蒿素是科技创新。2015年度科技创新人物中也说屠呦呦以“创新性地使用了低温萃取方法提炼出了可以治疗疟疾的青蒿素，这项研究是整个20世纪下半叶人类伟大的医学创举之一，也是中国科学家对人类的贡献”。
首先应该指出的是，1972年3月，屠呦呦得到的并非有效成分，而是有效乙醚中性提取物，是含有多种未知成分的混合物，需要进一步从中分离出有效成分；其次，乙醇和乙醚都是分离提取天然化学成分常用的溶剂，只是乙醚的亲脂性更强，沸点较低，经过酸、碱处理也是一种常规提取流程，绝不是什么新发现，1972年报告中的说法是可信的；其三，当时对中药青蒿的有效成分一无所知，所谓对热稳定或不稳定只是一种猜测，更无从谈到“创新”与否。
我们从以后全国各有关单位所采取的提取用溶剂看，云南药物研究所用溶剂汽油（沸程88℃～120℃）常温浸取，减压回收（60℃～70℃），50%乙醇溶液重结晶；山东中医药研究所用丙酮（沸点56℃）热提或冷浸，减压回收；四川省中药研究所用稀醇法常温浸取均获得成功；说明从青蒿中提取青蒿素可以采用的溶剂沸点范围比较广，减压回收溶剂，青蒿素均未见被破坏。在诸多方法中，只有中药研究所采取的乙醚提取法，由于乙醚的易燃易爆性质，无法大规模提取。因此青蒿素必须低温提取的说法并无事实根据。
1973-1974年时，大家对青蒿素的化学结构知之甚少，仅知其熔点约为156℃～157℃,但不清楚其分解温度是多少。直至1975年上半年中国科学院上海有机化学研究所在鹰爪甲素结构的启发下，证实了青蒿素分子结构中的5个氧原子组成了除了一个内酯环之外，还含有一个过氧桥[7]。1975年11月，中国科学院生物物理研究所用X射线单晶衍射方法确证了青蒿素的初始的晶体和分子立体结构，1977年底最后成功地用X射线反常散射，确证其绝对构型 [8]；中国科学院上海药物所又证实了这个过氧桥是青蒿素抗疟作用的关键[7]，人们才开始思考，青蒿素作为一个有机过氧化合物，按照过氧化合物的特性，青蒿素应该是不稳定的，但是种种试验表明青蒿素是一个对光和热都比较稳定的化合物。
1979年中科院生物物理所就已经指出，“青蒿素分子中五个氧原子都集中在分子的一侧, 且从O5起有一条碳氧链O5―C12―O4―C7―O3― C8―O1―O2―C6，其中碳氧键长自C12―O4起顺序以短、长、短、长、短的方式连接起来, 而且都介于正常单键和具有部分双键键长之间。由于每个氧原子上都有孤对电子, 可能每个氧原子上的孤对电子已不局限于氧原子上, 而发生了键型的变异, 这有助于使整个分子趋于稳定, 这与青蒿素分子或晶体表现出对热和光照的稳定性相吻合。而这一条碳氧链, 可能就是青蒿素分子有着特定效能的部位” [8]。
中国医学科学院药物研究所梁晓天认为，虽然青蒿素对强酸、强碱不稳定，但是青蒿素在中性非极性溶剂中保持稳定的温度至少可达150℃ [9]。中药研究所化学室罗宣德和美国全国卫生研究所(NIH)的同行将青蒿素在不同沸点的溶剂中加热，结果证明，青蒿素在乙醇（注：沸点78.4℃）中回流2天，或在甲苯（注：沸点 110.5 ℃）中回流4天，经薄层层析检查，香兰醛显色，仍未见有分解产物 [10]。1985年美国华尔特里德陆军研究院（Walter Reed Army Institute of Research）的Lin AJ，和Klayman DL等研究青蒿素分子的热重排和热分解，认为青蒿素纯品可耐受200℃ 高温2.5min, 如超过3.5min或在190℃ 下保持10min则会发生变化[11]。因此，青蒿素相较一般过氧化物而言，其热稳定性是超乎寻常的。
2007年武汉大学化学与分子科学学院董家新等用绝热量热法测定青蒿素晶体在80K 至363K低温范围的克分子热容和热稳定性。作者以热重量仪－红外光谱联用，测定青蒿素的热变化，从差热分析曲线观察到青蒿素的两步热变化主要在420至620K之间，吸热峰和青蒿素熔融同时发生在420K，放热峰发生在紧接吸热峰之后，分子重排及分解同时发生在480K[12]，显示青蒿素在熔融时还未发生分解，但是二者的吸热峰和放热峰非常接近。
2014年南京理工大学高海素用差示扫描量热仪，分别研究了青蒿素及其衍生物青蒿琥酯、蒿甲醚和双氢青蒿素-1*在线性升温条件下，青蒿素的熔化温度最高，发生热分解失控的可能性最小。在等温条件下，青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚和双氢青蒿素的热分解反应属于自加速分解，其自加速分解温度（SADT值）分别为95℃、77℃、78℃和 58℃, 其中，双氢青蒿素-1*的热危险性最高[13]。
早在1970年屠呦呦的组员余亚纲及军事医学科学院顾国明和焦岫卿就已经证明，用北京中药青蒿市售品的乙醇提取物，对鼠疟的抑制率为60～80%（顾国明提供）或90%以上（焦岫卿提供）[7]。1972年3月屠呦呦报告认为，必须将乙醇提取改为乙醚提取，其实关键不在乙醇，也不是必须低温提取， 关键在所用的药材来源。他们所采用的北京的市售青蒿都是药材公司从当地收购的野生植物黄花蒿，能否从这些干燥的药材分离到有效部位取决于药材的植物品种、生长环境、采收时间和采集部位（花、叶、茎）。后来的研究证实，迄今为止，只有菊科植物黄花蒿（Artemisia annua L.）或大头黄花蒿（Artemisia annua L. f macrocephala Pamp.）含有青蒿素这种抗疟活性成分；青蒿素在植物的花含苞欲放时，在叶子中的含量最高，随着花开后，叶子中的含量就迅速下降，此时花中的含量比叶中最高含量还要高，青蒿素积聚的高峰期也不过1周左右。
从生长地区来看，北京植物黄花蒿的青蒿素含量比南方草低得多，相对杂质就更多，分离提取的难度比较大，这就是当年中药所面临的问题。四川、海南生长的黄花蒿中有效成分含量高，杂质相对就较少，分离提纯就比较容易。因此，北京产的黄花蒿的质量差，就是当年中药所重复用乙醚提取青蒿素屡屡失败的原因之一。后经测定北京产的鲜活的黄花蒿，其中的青蒿素含量大大低于海南。这些影响因素是直到1977年建立了测定方法的灵敏度达到微克/毫升，才能准确地回答这些问题。下表是作者1978年在中药研究所生药研究室工作时，比较影响植物黄花蒿中青蒿素含量的诸因素所得的数据。提取所用的溶剂以石油醚（60℃～90℃）最佳，含量测定方法为薄层层析-紫外分光光度法。青蒿素平均回收率为94.2%[14]**。
**作者1976年受中药研究所领导指派，筹建青蒿质量组，1977年参与全国青蒿素含量测定和质量研究，1978年负责和技术员付桂兰共同完成此课题，并存档，论文则以生药研究室名义，被收集在中药所专辑[14]。屠呦呦在她的书中将此项研究据为己有，引用本表时未经作者同意，更未注明来源，还删去表中的工作年份（1978）和海南岛的全部数据[14]。
应该说，早期对青蒿素一无所知的情况下，屠呦呦1972年3月在会上报告试探用亲脂性较高的乙醚提取代替乙醇得到中性有效部分，证实其对鼠疟抑制有效，对以后的深入研究起到推动的作用，是应该肯定的，也是符合分离提取天然化合物的常规操作，但和葛洪的“绞汁服”并无关系，无非是表示“继承”了古代中医典籍的说法而已。后来却又不断强调提出用乙醚是低温提取是发现青蒿素的关键性突破。
经过将近40年的科研实践和对其特殊化学结构的破解，说明青蒿素和一般有机过氧化物相比，对热比较稳定是得益于其令人叹为观止的特殊化学结构。因而青蒿素无需低温提取，乙醚更不是必须的溶剂，也不适用于工业化生产。但是到2015年屠呦呦在诺贝尔奖颁奖会演讲时，还认为是由于改进了用乙醚低温提取，得到有效中性部分这个突破性发现，成为发现青蒿素的关键性一步[15]。这种坚持青蒿素低温提取突破的说法就有违科学实践，至今不予纠正，是不应该的。而苏新专和米勒所谓低温提取法“提高了其活性成分的稳定性”则更是无稽之谈了。
*作者退休前为中国中医科学院中药研究所分析化学室研究员，1990年退休后，受聘于军事医学科学院五所任客座教授。本文涉及到的专业问题较多，作者未必都能说清楚，如有错误之处，欢迎指正。
本文原载《科学春秋》，《知识分子》获授权刊发。
参考文献:
[1] Evelyn Strauss, Lasker Foundation 2011Winners Lasker-DeBakey Clinical Medical Research Award Award Description（http://www.laskerfoundation.org/awards/2011_c_description.htm）
[2] Su XZ and Miller L.H.,The discovery of artemisinin and the Nobel Prize in Physiology or Medicine, Science China (Life Sciences) 2015 (11):1175-1179
[3]黎润红，饶毅、张大庆，“523任务”与青蒿素发现的历史探究,自然辩证法通讯，2013 , 35 (1):107-121
[4]中医研究院疟疾防治小组，用毛泽东思想指导发掘抗疟中草药工作。1972年3月4日
[5]屠呦呦, 青蒿素及青蒿素类药物[M].北京: 北京化学工业出版社, 2009.31～34页
[6] Youyou Tu, The discovery of artemisinin(qinghaosu) and gifts from Chinese medicine，Nature Medicine，17(10):xix-xxii，October 2011
[7]李国桥,李英，李泽琳，曾美怡等，青蒿素类抗疟药[M]，北京:科学出版社, 2015
[8]中国科学院生物物理研究所青蒿素协作组，青蒿素的晶体结构及其绝对构型，中国科学，1979（11）：1114-1128
[9] Zeng,M, Li LN,Chen SF,Li CJ, Liang XT, Chen M, Clardy J. .Tetrahedron, 1983, 39:2941
[10]Luo XD,Herman J.C.Yeh, and Arnold Brossi .Heterocycles, 23(4):881-887 1985
[11] Lin AJ, Klayman DL,and Hoch JM, Thermal rearrangement and decomposition products of artemisinin, J Org Chem 1985,50:4504-4508
[12]Dong JX, DanYM,TanZC,Zhao JN,Liu Y, Low temperature molar heat capacities and thermal stability of crystalline artemisinin ,Thermochimica Acta, 463 2-5(2007)
[13]高海素，青蒿素及其衍生物的热稳定性研究，2014硕士论文
[14] 中药研究所生药室，中药青蒿的青蒿素含量测定方法的研究（二），中医研究院中药研究所，青蒿抗疟研究（1971-1978）：122～130
[15] Youyou Tu Nobel Lecture (http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2015/tu-lecture.html
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